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本制品是采用N01/PI双染法染色活细菌和死细菌，利用活死细菌的膜通透性改变进行的检测，适用于荧光显微镜和流式细胞仪。本测定原理适用于大多数细菌类型，包括各种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。

N01活细菌核酸染色探针为绿色荧光标记的活细菌探针，具有500/525nm的最大激发/发射波长。当膜通透性的绿色荧光探针N01进入细菌后，选择性的跟DNA结合。染色探针N01在进入细胞膜之前荧光较弱，当与DNA结合后其荧光强度大大增强，被激发后可以发出绿色的荧光，具有很高的淬灭常数和激发态寿命。

红色核染色染PI不能穿过活细菌的细胞膜，它仅穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488，545nm，发射：617nm)，因此PI仅对死细胞染色。

由于N01-DNA和PI-DNA都可被488nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。根据以上特点，N01和PI可以被结合用来作为活细菌和死细菌的双重染色。

荧光探针N01除了最简单的细菌核荧光标记外，还可以用于荧光成像，微孔板分析和流式细胞术。在合适的滤光器下，这种DNA结合染料与其他颜色的荧光染料一起可用于活细菌的多种颜色分析。

细菌活力的常见标准是细菌在合适的营养培养基中繁殖的能力生长测定，使用本试剂盒产生的结果与液体或固体培养基中的生长检测相关性良好。但是需要注意，不同于动物细胞，在一定的条件下，具有损伤膜的细菌可能能够恢复和繁殖，这种细菌可以在本试剂盒的测定中被检测为“死亡”。相反，一些膜完整的细菌可能无法在营养培养基中繁殖，然而这些细菌可能被记为在这个测定中被检测为“活着”。如果在该测定法和细菌之间观察到相当大的差异，应该考虑这些可能性。

• 染料长期不用可以-20℃保存，避免反复冻融。
  
• 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
  
• 试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
  
• 建议收到产品后，根据单次使用量，对N01母液进行小量分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 所有染色液操作在塑料容器进行，不要在玻璃容器染色。
  
• 以下为进行活死细菌染色观察的参考步骤，可以根据文献的方法进行调整。如果有必要，也可以设定对照活细菌和死细菌，进行定量检测。可以可以根据需要自己设定对照和检测方法。
  
• 标记的条件因细菌种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
  
• 流式检测时建议添加直径6.0μm微球标准品。
  
• 细菌类型会明显影响红色荧光的量。
  关于细菌死/活的定义标准：
  
• 需要注意任何单一指标判断细菌死活的局限性。就单个细菌样本的生理状态而言，并不容易定义生存能力或形态参数，因此进行单个指标的生存力测定可能会在实验中引入特定的偏见。
  
• 本制品的这种LIVE/DEAD细菌膜通透性染色测定与在合适的液体或固体营养培养基中进行生长分析的其他细菌生存力的标准一般需要结合分析。在某些情况下，细菌膜受损可能会恢复和繁殖，即使此类细菌在本制品分析中可能被评为“死亡”。相反，某些具有完整膜的细菌可能无法在营养培养基中繁殖，但在本制品分析中被评为“活”。
  
• 几种不同生存能力衡量指标，例如膜渗透性，酶活性和氧化还原电位需综合分析评判，才可能提供更多彻底评估细菌生存力并清除固有任何单一生存力测定法的局限性。

• 根据样品数按下列比例配制染色工作液。
  用37℃培养箱预热0.85% NaCl溶液将N01荧光染料进行500倍稀释，将PI进行100～500倍稀释，配制成染色工作液。
  例如：
  每10mL 0.85% NaCl溶液中加入20μL染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
  每10mL 0.85% NaCl溶液中加入20～100μL染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。。
  
  • 由于不同细菌的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定N01和PI的最适浓度。梯度筛选原则为使用最低探针浓度得到最好的荧光结果。为了降低探针加载过度可能引起的假阳性，建议在不影响染色效果的情况下尽量使用低浓度。
    
  • 开始实验前，使用0.85% NaCl溶液稀释染料储存液到需要的工作浓度。工作浓度应根据不同细菌的预实验结果确定的最佳工作浓度，建议至少在超过10倍范围的浓度下进行测试。
    
  • 一般N01染色终浓度为试剂盒中染料母液的500倍稀释适合大多数细菌样本。极个别细菌样本可能需要提高染色浓度至200倍稀释。
    
  • PI的使用终浓度为染料母液的100～1000倍稀释，150～300倍适合大多数细菌样本。
    
  • N01和PI可以混合在一起染色，也可以分开进行染色。初次实验时，最好分开染色。经过多次实验优化后，能确定两种染料的最佳浓度后可以混合在一起染色。
    
  • 两种染料的比例根据情况进行调整，如果绿色过于突出，可以降低N01的浓度或者稍微提高PI的浓度；如果红色过于突出，则增加N01的用量或降低PI的用量。
    
  • 注意PI的浓度在染上色的前提下尽可能低，否则可能有细胞毒性，使原本的活细胞染上色。
    
  • 确定了染色终浓度以后，可以将染色液配制成100×的工作液，使用时按每100μL细菌悬液中加入1μL染色液，充分混匀后染色。
• 细菌染色：
  
  • 收集样本细菌，用0.85% NaCl溶液洗涤细胞3次。
    
    • 必须充分洗涤以去除培养基，残余的培养基会影响染色效果。
      
    • 不要用PBS等磷酸盐缓冲液洗涤，会影响染色效果。
      
    • 一般10000×g下离心10～15分钟沉淀细胞。
  • 用100μL～200μL染色工作液将细菌重悬。
    
    • 也可先用0.85% NaCl溶液制备细胞悬液，然后按比例加入100×的染色工作液。
      
    • 初次实验时两种染料分别染色。
  • 在室温避光孵育15分钟。
    
  • 用0.85% NaCl溶液洗涤细菌一次。
    
  • 用适量0.85% NaCl溶液重悬细菌。
    
  • 将5μL菌液滴加到载玻片，盖上盖玻片，油镜观察。
    
  • 用荧光显微镜观察。激发波长为488nm，最大发射波长为525nm和617nm。
    
    • 在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以再次清洗掉细胞外的染料后再观察。

• 不同的细菌类型会明显影响荧光的量。
  
• 建议的染色条件染色以下细菌类型显示出良好的相关性，其它细菌类型请在以下范围或超过以下浓度范围内测试最佳染色条件：Bacillus cereus,B.subtilis,Clostridium perfringens,Escherichia coli,Klebsiella pneumoniae,Micrococcus luteus,Mycobacterium phlei,Pseudomonas aeruginosa,P.syringae,Salmonella oranienburg,Serratia marcescens,Shigella sonnei,Staphylococcus aureus,Streptococcus pyogenes,Agrobacterium tumefaciens,Edwardsiella ictaluri,Eurioplasma eurilytica,Lactobacillus sp.,Mycoplasma hominus,Propionibacterium sp.,Proteus mirabilis and Zymomonas sp.。
  
• 标记条件因细菌种类而异，根据不同样本实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细菌类型、细菌的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。